Учёные впервые увидели запуск репликации ДНК в живой клетке и нашли молекулярный механизм расплетения генома

Начальное плавление ДНК зафиксировали с точностью до пары оснований

Учёные впервые смогли в деталях проследить процесс запуска репликации ДНК внутри живых клеток с точностью до отдельных пар оснований.

Перед делением клетка должна полностью скопировать свой геном. Для этого задействуются специальные белковые моторы — хеликазы (helicase, от лат. helix — спираль), ферменты, разделяющие 2 цепи двойной спирали ДНК. Главный «молекулярный мотор», — хеликаза, которая расплетает двойную спираль ДНК на две отдельные цепи перед делением клетки — комплекс MCM2-7.

Этот комплекс собран из шести разных белков-субъединиц (от Mcm2 до Mcm7). В неактивном состоянии MCM2-7 состоит из 6 субъединиц и формирует двойное кольцо вокруг ДНК в специфических точках старта. Ранее специалисты не могли точно зафиксировать в живой клетке момент, когда эти 2 кольца разделяются, где именно начинает расплетаться ДНК и как одна из цепей выходит наружу.

Чтобы пошагово зафиксировать переходный процесс, авторы работы применили методы химической генетики на клетках дрожжей. С помощью молекулярных защёлок специалисты соединили соседние субъединицы белка Mcm4 одного кольца и Mcm5 другого. Блокировка физического разделения колец привела к остановке клеточного цикла и снижению синтеза ДНК более чем на 70% через 60 минут после выхода из фазы покоя G1.

Это показало, что механический разрыв двойного кольца (гексамера) служит жёстким условием для своевременного высвобождения белков-активаторов Sld3 и Mcm10.

Исследование всех 6 потенциальных интерфейсов белкового кольца показало, что роль молекулярных ворот для выхода одной из цепей ДНК выполняет стык субъединиц Mcm2/5. Блокирование этого участка позволяет провести начальное плавление молекулы, но полностью останавливает дальнейшую элонгацию (продление синтеза), так как 2 активированные хеликазы физически не могут пройти мимо друг друга с закрытыми воротами.

Нарушение работы этого интерфейса оказалось летальным для клеток.

Используя методы геномного картирования высочайшего разрешения (ChIP-Exo 5.0 и PIP-seq), специалисты установили, что первичное расплетение спирали стартует точно в центре — в точке контакта 2 белковых колец. Структура ДНК в этом месте устроена особым образом: её плотный центральный участок окружён фрагментами, которые легко поддаются разрыву. Из-за такой архитектуры спираль быстро деформируется и расходится под физическим давлением белкового мотора.

Анализ одноцепочечной ДНК показал появление первых расплетённых участков через 15 минут после перехода клеток в фазу синтеза ДНК. Авторы работы проследили, как область контакта белка с ДНК расширяется с 64 пар оснований до промежуточных значений в 72 пары оснований и затем до 138 пар оснований при разделении колец и привлечении ферментов-полимераз.

Исследование впервые связало разрозненные шаги запуска копирования ДНК в единую пошаговую карту: от расхождения белковых колец и выталкивания одиночной нити через молекулярные ворота до разделения копирующих комплексов в разные стороны. Так как эти базовые белки устроены одинаково у дрожжей и человека, понимание точной механики процесса позволит выяснить, как клетки сохраняют стабильность генома и почему сбои на этапе удвоения ДНК приводят к опасным мутациям.